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基因工程中Ca2+处理细菌是增加细胞壁还是细胞膜的通透性?

2012-01-09 09:01:10
分类:

 

基因工程中,用CaCl2处理细菌,增加其通透性的是细胞膜还是细胞壁?
(2011-03-01 10:41:24)

 

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细菌的细胞 壁除支原体外,几乎所有的细菌都有细胞壁。细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖,它使得这层壁坚韧并富有弹性。一旦失去细胞壁,所有的细菌都将变成球形。细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等,而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。细菌的细胞壁是多孔性的,可容许水和一些化学物质通过,但大分子的物质不能通过
 高等教育出版社的《现代分子生物学》中没有明确指出作用部位和原理:将快速生长中的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中,便会造成细胞膨胀(形成原生质球),并与转化混合物中的外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。立即将该体系转移到42度下做短暂的热刺激,复合物便会被细胞所吸收。”  
转化 把纯化的DNA导入细菌细胞的过程称为转化。原核细胞的转化过程就是导入外源DNA的过程。对于大肠杆菌来说,人们一般采用先用冰冷的CaCl2处理,然后置于42°C高温下帮助其吸收外源的DNA,这种方法的最大转化频率为10-3,其效率是每微克DNA一般可以转化107108个细胞。目前CaCl2转化方法的机制尚不清楚,可能是细胞壁被打了一些孔,DNA分子从这些孔洞中进入细胞,而这些孔洞随后又可以被宿主细胞修复。可以接受DNA的细胞称为感受态细胞。大肠杆菌需要诱导才能变成感受态细胞,而有些细菌细胞则在自然条件下,或是在改变培养基和其他培养条件下就可变成感受态细胞。
 
肠杆菌感受态细胞的制备和转化   
   
1
 感受态细胞的概念 
 

重组DNA分子体外构建完成后,必须导入特定的宿主(受体)细胞,使之无性繁殖并 
 

高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。 
 
   
在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。 
 
   
所谓的感受态,即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,它是由受体菌的遗传性状所决定的,同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期,新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 
 
   
制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15%的无菌甘油或-70保存(有效期6个月)。 
 
2
 转化的概念及原理 
 

在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内, 
 

使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。 
 
   
受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法,CaCl2等化学试剂法)处理后,使细胞膜的通透性发生变化,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 
 

大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法),该法最先是由Cohen1972年发现的。其原理是细菌处于0CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42短时间热冲击处理,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中,重组子中基因得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。 
 
Ca2+
处理的感受态细胞,其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA,可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上,联合其它的二价金属离子(如Mn2+Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌,则可使转化率提高100~1000倍。 
 

化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70保存,因此被广泛用于外源基因的转化。 
 

除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠短暂的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便,愈来愈为人们所接受。 
 
3
 感受态细胞制备及转化中的影响因素 
 

、细胞的生长状态和密度 
 

最好从-70-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已 
 

经过多次转接,及贮存在4的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株,OD60005时,细胞密度在5×107/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。 
 

此外,受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。 
 

、质粒DNA的质量和浓度 
 

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的,转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降。一般地,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%1ngcccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。 
 

对于以质粒为载体的重组分子而言,分子量大的转化效率低,实验证明,大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外,重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。 
 

、试剂的质量 
 

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯净的水配制,最好分装保存于4 
 

、防止杂菌和杂DNA的污染 
 

整个操作过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管,移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染,否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。 
 

、整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。
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